Определение гистамина методом тонкослойной хромотографии (ТСХ)

Л.И. ПИЛЬ, Т.В. БОЗИНА,• О.П: МИРОНОВА
Кубанский государственный университет

В некоторых продуктах питания в процессе хранения гистамин накапливается до токсического уровня, поэтому необходим контроль его содержания [ 1 ]. Существует несколько методов определения гистамина [у2-8]. Наиболее простым и не требующим дорогостоящего оборудования является метод тонкослойной хроматографии: Его недостаток — в сложности обработки результатов анализа. Для решения этой проблемы был разработан программно-аппаратный комплекс, позволяющий определять площади пятен на храматографических пластинках автоматически.

При разработке методики необходимо было выбрать оптимальные неподвижные и подвижные фазы, проявитель, режим хроматографирования, метод подготовки пробы и обработки результатов эксперимента. Исследовали три неподвижные фазы (СТХ-1.А, СТХ-1 ВЭ, Silцfal-UV 254). Наиболее четким и пригодным для количественного определения было изображение пятен на пластинке мар¬ки Silт.ifol-UV 254. При выборе подвижной фазы опробовали более 30 элюирующих систем. В каче¬стве оптимальной выбрана система этанол—аммиак (7:3). При ее использовании hf гистамина равен 0,33-0,35. Для проявления пятен гистамина при¬меняли 0,5%.й раствор хингидрина в изоамиловом спирте, при котором хроматографическая картина была наиболее четкой. Полученные пятна производного гистамина устойчивы в течение 12 ч.

На модельных растворах провели исследование влияния гистидина на определение гистамина, Установлено, что эти вещества имеют близкие значения Rt — 0,35 и 0,43. Для отделения гистамина от гистидина применили прием двойного элюирования. Хроматографическую пластинку с нанесенными на нее пробами опускали в раствор подвижной фазы и проводили храматографирование до того момента, пока фронт растворителя не прошел примерно половину пути. Пластинку вынимали и высушивали. Затем ее снова опускали в раствор того же состава и проводили хроматографирование до конца. Использование этого приема позволило разделить смесь гистидина и гистамина, К, составил соответственно 0,68 и 4,36.

При хроматографировании образцов рыбы некоторые амины и аминокислоты, которые не удалось отделить при пробоподготовке, мешают определению гистамина. Они имеют величину Р больше, чем у гистамина, и при проявлении нингидрином оставляют сзади себя след, сравнимый по интенсивности с пятном гистамина данная проблема была решена при проведении двумерной хромотографии на пластинках размером 10х 10 см с использованием двойного элюировавия в системе растворителей этанол: аммиак (7:3) в обоих направлениях. Одновременно с анализируемым раствором на пластинку наносили два раствора стандарта, что позволяло производить идентификацию гистамина на полученной хроматограмме. Оптимальный объем пробы, нанесенной на пластинку, 3 мкл.

Большое внимание уделяли пробоподготовке исследуемых образцов. Выбрали вариант пробоподготовки, основанный на ряде избирательных экстракций гистамина в х-бутанол и соляную кислоту [4], и модифицировали его применительно к тонкослойной хроматографии (ТСХ). В ходе такой пробоподготовки в пробе оставалось минимальное количество мешающих определению гистамина аминов и аминокислот.

Для количественного определения гистамина использовали метод градуировочного графика. В диапазоне концентраций 0,5-4 мг/мл гистамина зависимость tiiQ от 1п т линейная (Q — площадь пятна, т — масса вещества в пятне).
Таблица
Показатели Содержание гистамина
н образках, иг/гг
1 t
Номер определения:
94,3 103,1
г 9г,1 102,8
3 91,8 104.1
4 94,5 104,4
5 93,9 103,7
S 1,3 0.6
X±Δ 93,3± 1,8 103,6 -0,8

Для определения площади пятна на базе персо­нального компьютера и устройства ввода изобра­жения (сканера) был разработан программно-ап­паратный комплекс.  Изображение хромотаграфических пятен посредством сканирования вводились в память компьютера и обрабатывались.

Применение такого комплекса позволило peшить вопросы документирования, хранения, обработки и вычисления результатов анализа гистамина, проводимого методом тонкослойной хроматографии.

Разработанная методика была опробована на образцах рыбы. Полученные результаты представ лены в таблице (n = 5; P = 0,95). Проведенная метрологическая оценка методики выявила следующие ее характеристики: предел обнаружения метода —- 75 мг/кг, степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина — 92—96%.

Общее время анализа ‚5 ч.

BЫВОДЫ

Разработана методика определения гистамина в рыбе методом тонкослойной хроматографии, Выбран сорбент для проведения анализа —— пластинки для хроматографирования марки Silufol (10X10 см).

Определена оптимальная смесь растворителей для хроматографирования — этанол:аммиак (7:3).

Подобран проявитель для обнаружения гистамина— О,5%—й раствор нингидрина в изоамиловом спирте.

Предложено проведение двумерной хроматографии с применением двойного элюирования для более полного отделения гистамина от мешающих определению веществ.

Разработан продраммно-аппаратный комплекс, предназначенныи для автоматизации обработки результатов анализа, повышающий объективность и экспрессность метода.

Проведены метрологические исследования и установлены некоторые метрологические характеристики разработанной методики анализа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Методические указания по фотометрическому определению ‚гистамина в рыбопродуктах. (Доп. к документу ”Временные гигиенические нормативы и методы определения содержания гистамина в рыбопродуктах». СанПиН 42-123-4083-86). — М,: OH’11/1 151-11413 , 1988.
2. Rosier Jan., Van Peteghem Carlos. A screening method simultaneous determination of putrescine, cadaverine, histamine. spermidine in fish by means of HPLC 01 their 5~dimeth Izminonaphtaline»1»sy1phony1 derivatives // Z. Lebensm.~{1ntersuch. шп} Forsch. — 1988. — 186 (1). — 5. 25-28.
3. Галутва О.А., Головин А.Н., Крюкова ЕВ… Жукова Г.Ф. Определение содержания гистамина в рыбных продуктах // Рыбное хоз—во. — 1987. —№ 9. — С. 73— 4.

Полностью статью можно скачать по ссылке ниже.